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Umrechnung der optischen Dichte in cfu / ml

Umrechnung der optischen Dichte in cfu / ml



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Ich habe Probleme, die Korrelation zwischen OD-Messungen und KBE/ml zu verstehen. Was ist der Umrechnungsfaktor zwischen den beiden Einheiten, und kompensiert dieser Umrechnungsfaktor irgendwie die toten Zellen, die OD möglicherweise liest? (Angenommen, der OD ist auf den Standard 600 nm eingestellt).


Die Messung der optischen Dichte ist die Menge an lebenden und nicht lebenden Zellen in einer Probe. Die Koloniebildungseinheit misst nur die lebensfähigen Zellen in einer Probe. Eine OD 600 nm entspricht ungefähr 8 x 10^8 KBE/ml. Dies ist jedoch nur ein Näherungswert und kann die toten Zellen, die die OD möglicherweise liest, nicht vollständig berücksichtigen, es hängt auch vom untersuchten Mikroorganismus ab. Aus den Daten kann eine Standardkurve berechnet werden, aber es ist ziemlich schwierig, ein genaues Ergebnis zu erzielen. Einen sehr nützlichen Artikel zur Korrelation zwischen den beiden Messungen finden Sie hier (aus dem Brazilian Journal of Microbiology).


OD und KBE/ml - (13. Februar 2009 )

Ich habe immer das Problem, die OD anzupassen, um bestimmte KBE/ml zu erhalten. Gibt es das trotzdem?

Wie korreliert OD mit CFU? optische Dichte zu Partikeln nur bei Kalibrierung

Nrelo sagte am 13. Februar 2009 um 04ᚳ:

Wenn ich mich richtig erinnere, besteht die Beziehung zwischen OD und CFU darin, dass OD sowohl lebende als auch tote Zellen misst (optische Dichte der Lösung, die Zelltrümmer enthält), während sich CFU auf Organismen bezieht, die auf Agarplatten wachsen können (der Teil, der in deine Lösung). Ich bin mir nicht sicher, ob es eine Möglichkeit gibt, zu sagen, dass Sie bei einer bestimmten OD eine entsprechende Anzahl von CFU erhalten. Vielleicht, wenn Sie die Messung in der Log-Phase durchführen, in der sie glücklich wachsen und wo es nicht zu viele tote Zellen gibt.

SEHR grob ist 1 OD 1e9 Zellen/ml

phage434 sagte am 13. Februar 2009 um 11:00 Uhr:

Ja, das ist der häufigste Wert, von dem ich gehört habe

Kalibrieren Sie Ihre Kurve auf den Mikroorganismus, den Sie untersuchen, und kontrollieren Sie die Anwendungsbedingungen (selbst bei gleicher OD ist eine KBE/ml einer Suspension, die eine Woche im Kühlschrank liegt, nicht dasselbe wie bei einer frischen Kultur.

GeorgeWolff sagte am 14. Februar 2009 um 05:00 Uhr:

Wenn wir Infektionen durchführen, plattieren wir das Infektionsmedium, das Inokulum oder was Sie zur Infektion verwenden.
Auf diese Weise können Sie überprüfen, ob es sich bei Ihrer OD und der bact/ml (1 OD entspricht ungefähr 1e9 bact/ml) um lebende/tote Bakterien handelt, und Sie kennen die genaue KBE, die Sie zur Infektion verwendet haben.

genau, das haben wir früher auch so gemacht. und es ist für jeden Fehler anders, die meisten Näherungen, die Sie sehen, basieren auf E coli. Sie könnten Ihren Fehler ein paar Mal validieren, um eine Vorstellung zu bekommen, aber es ist immer noch ratsam, jedes Mal zu plattieren und mit Verdünnungen zu infizieren, um sicherzugehen.


Neuropeptid-Technologie

F. M. Laurent-Huck , J. M. Felix , in Methods in Neurosciences , 1991

Verwendung der Kalibrierkurve

Die mittlere OD wird über jeden Standard gemessen und im Computerspeicher eingestellt. Die gemessene Fläche ist nicht kritisch, da die mittlere OD pro Flächeneinheit berechnet wird. Um leichte Variationen in der Verteilung des radioaktiv markierten Materials auszugleichen, ist es besser, die OD über den fast vollständigen Standardbereich zu messen.

Aufgrund der nichtlinearen Beziehungen zwischen Radioaktivität und Filmreaktion können verschiedene mathematische Transformationen zur Kalibrierung verwendet werden. Mit 35 S β Strahlungen und β -Max Hyperfilms, die Beziehung zwischen OD und Radioaktivität kann als linear betrachtet werden (r ≥ 0,98) zwischen 0,05 und 0,5 OD-Einheiten ( 8 ). Polynomtransformationen zweiter Ordnung zeigen oft gute Korrelationen (r ≥ 0,99) zwischen 0,05 und 0,8 OD-Einheiten ( Abb. 8 ). Eine Transformation wie log(conc) = F [log(OD)] ist eine weitere Möglichkeit, die getestet werden kann. Unabhängig von der gewählten Kurve sind für genaue Ergebnisse OD-Werte unter 0,01 (Schwellenempfindlichkeit des benachbarten Films und/oder Nachweisgrenze des Bildanalysators) und OD-Werte über 0,8 Einheiten (annähernde Filmsättigung,

1 OD-Einheit für β -Max Hyperfilms) sind zu vermeiden. Eine erneute Exposition der Schnitte für kürzere oder längere Zeit sollte zu geeigneteren OD-Messungen führen. Gesamt- oder unspezifische Daten für die interessierenden Bereiche auf den experimentellen Abschnitten werden dann vom Computer aus der Standardkurve berechnet.

Abb. 8 . Kalibrierkurven, die eine polynomische (a) und eine lineare (b) Beziehung zwischen optischer Dichte und Radioaktivität veranschaulichen.


Das Lambert-Beer-Gesetz und OD600

Das Lambert-Beer-Gesetz, auch bekannt als Beer’s Law, setzt die Lichtabsorption empirisch in Beziehung zu den Eigenschaften der Probe. Dieses Gesetz besagt, dass es eine logarithmische Beziehung zwischen der Transmission von Licht durch eine bestimmte Probe (T = I/Io mit I = austretendes Licht und Io = einfallendes Licht), dem molaren Extinktionskoeffizienten für eine bestimmte Verbindung (ε), der Konzentration der absorbierenden Spezies im Material (c) und die Entfernung, die das Licht zurücklegt (d).

OD-Schätzungen wurden mit Schätzungen der Bakterienkonzentration (C) oder Anzahl (N) nach dem Lambert-Beer-Gesetz synonym. Obwohl Messungen von OD tatsächlich Trübungsmessungen sind, können wir daher das Lambert-Beer-Gesetz mit bestimmten Überlegungen nur auf mikrobielle Kolonien geringer Dichte anwenden.


Robuste Schätzung der Bakterienzellzahl anhand der optischen Dichte

Die optische Dichte (OD) ist eine schnelle, kostengünstige Messung mit hohem Durchsatz, die häufig verwendet wird, um die Dichte von Zellen in Flüssigkulturen abzuschätzen. Diese Messungen können jedoch nicht zwischen Geräten ohne ein standardisiertes Kalibrierungsprotokoll verglichen werden und sind schwierig mit der tatsächlichen Zellzahl in Beziehung zu setzen. Wir adressieren diese Mängel mit einer Ringversuchsstudie, in der drei OD-Kalibrierungsprotokolle verglichen wurden, die auf acht Stämme von . angewendet wurden E coli entwickelt, um konstitutiv unterschiedliche Mengen an GFP zu exprimieren. Diese drei Protokolle – Vergleich mit kolloidalem Silica (LUDOX), serielle Verdünnung von Silica-Mikrosphären und ein Referenz-Colony-forming-Unit-Assay (CFU) – sind alle einfach, kostengünstig und leicht zugänglich. Basierend auf den Ergebnissen der 244 Teams, die diese Ringversuchsstudie durchgeführt haben, empfehlen wir die Kalibrierung der OD durch serielle Verdünnung von Silica-Mikrosphären, die leicht eine hochpräzise Kalibrierung (95,5% der Teams mit Restwerten von weniger als 1,2-fach) ermöglicht, die leicht auf Qualität bewertet werden kann Kontrolle und bewertet als Nebeneffekt auch den effektiven linearen Bereich eines Instruments. Darüber hinaus können Schätzungen der Zellzahl von Silica-Mikrosphären mit einer Fluoreszenzkalibrierung gegen Fluorescein kombiniert werden, um Einheiten von Molekülen von äquivalentem Fluorescein (MEFL) zu erhalten, was einen direkten Vergleich und eine Datenfusion mit äquivalent kalibrierten Durchflusszytometriemessungen ermöglicht: in unserer Studie Fluoreszenz pro Zelle Messungen zeigte nur einen 1,07-fachen mittleren Unterschied zwischen Plattenleser- und Durchflusszytometriedaten.


OD600-Messungen: Tipps zur Umsetzung

Die Messung der optischen Dichte bei 600 nm ist eine einfache und weit verbreitete Methode, um das Wachstum von Mikroorganismen in Flüssigkulturen zu überwachen und deren Zellzahl zu bestimmen.

Bildquelle: Shutterstock: 1094575550

Obwohl einfach, ist diese Technologie nicht zu unterschätzen. Eine Kultur von Mikroorganismen stellt eine Suspension dar, so dass Licht bei der photometrischen Messung hauptsächlich gestreut und nicht absorbiert wird. Die Lichtstreuung wird hauptsächlich durch die Form und Größe des Organismus sowie durch das Design des Photometers beeinflusst [1, 2]. Das bedeutet, dass aus den gemessenen OD-Werten (Optische Dichte) keine Zellzahl oder Biomasse direkt berechnet werden kann. Eine solche Umrechnung erfordert eine vorherige Kalibrierung des Photometers mit dem kultivierten Stamm, was die Erstellung einer Standardkurve beinhaltet [2].

Die Standardkurve kann auf unterschiedlichen Parametern basieren, je nachdem welcher Faktor für das vorliegende Experiment relevant ist. Ist beispielsweise die Biomassezunahme einer Kultur von Interesse, können die aus verschiedenen Verdünnungen einer Kultur erhaltenen optischen Dichten gegen das für diese Proben ermittelte Trockengewicht aufgetragen werden. Diese Methode eignet sich ebenso gut zur Bestimmung des linearen Bereichs der Probe innerhalb dieses speziellen Photometers. Die lineare Beziehung zwischen OD600 und die Konzentration ist bei Streulichtmessungen im Vergleich zu Extinktionsmessungen sehr begrenzt, da höhere Dichten zu einer Mehrfachstreuung zwischen den Partikeln führen. Dieser Effekt erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass schließlich mehr Licht den Detektor erreicht. Die resultierende Standardkurve zeigt, bis zu welcher optischen Dichte die Werte einem linearen Verlauf folgen.

Wenn es wichtig ist, die Anzahl der lebenden Zellen innerhalb einer Kultur zu bestimmen, wird OD600 gegen die Zahl der lebenden Zellen aufgetragen werden (tote Zellen und Zelltrümmer tragen ebenfalls zur Lichtstreuung bei). Dazu werden zu mehreren Zeitpunkten Proben aus der Flüssigkultur entnommen. Ein Teil der Probe wird bei 600 nm mit einem Photometer gemessen, während der andere Teil der Probe einer seriellen Verdünnung unterzogen wird. Ein definiertes Volumen jeder Verdünnung wird dann auf eine separate Agarplatte ausgestrichen und inkubiert. Die Anzahl der auf den Platten gewachsenen Kolonien wird gezählt, und die koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml oder die Zellzahl der ursprünglichen Kultur können entsprechend berechnet werden (Abbildung 1). Werden die Werte gegen die Konzentration aufgetragen, ergibt sich eine Kalibrierkurve, die als Grundlage für nachfolgende Messungen des gleichen Stammes mit dem gleichen Gerät dient.

Folgende Punkte sollten bei der Messung von OD . beachtet werden600: Da eine Kultur eine Suspension darstellt, ist die Homogenität der Probe entscheidend. Aus diesem Grund sollte die Kultur vor der Probenentnahme gut durchmischt und gegebenenfalls kurz vor der Messung wiederholt werden. Als Blindwert sollte das gleiche frische Kulturmedium dienen, das für die Kultur verwendet wird. Wenn jedoch eine höhere Genauigkeit erforderlich ist und sich das Medium im Laufe der Inkubation verfärbt, kann es von Vorteil sein, den Kulturüberstand als Blindwert zu verwenden. Überschreitet die gemessene optische Dichte den linearen Bereich, sollte die Probe mit Kulturmedium entsprechend verdünnt werden. Weitere mögliche Ursachen für schwankende Messwerte sind im White Paper 27 [3] aufgeführt.


S1-Datei.

Abb. A. Ergebnisse der Makrorestriktionsanalyse von 17 B. Bronchiseptika isoliert mit Salmonellen Typhimurium LT2-Marker und Restriktionsendonuklease XbaI. Abb. B. Messung der optischen Dichte (OD) von B. Bronchiseptika Referenzstamm DSM 10303 in vier Medien Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. Abb. C. Optische Dichte (OD) von B. Bronchiseptika Typstamm DSM 13414 in vier Medien, Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. Abb. D. Optische Dichte (OD) von B. Bronchiseptika Feldisolat Bb5/12 in vier Medien, Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. Abb. E. Optische Dichte (OD) von B. Bronchiseptika Feldisolat Bb24/12 in vier Medien, Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. Abb. F. Anzahl (log KBE/ml) der Bakterien (B. Bronchiseptika Referenzstamm DSM 10303) in einem Mittelwert von vier Medien aus drei unabhängigen Experimenten. Abb. G. Anzahl (log KBE/ml) der Bakterien (B. Bronchiseptika Typstamm DSM 13414) in einem Mittelwert von vier Medien aus drei unabhängigen Experimenten. Abb. H. Anzahl (log KBE/ml) der Bakterien (B. Bronchiseptika Feldisolat Bb5/12) in einem Mittelwert von vier Medien aus drei unabhängigen Experimenten. Abb. I. Anzahl (log KBE/ml) der Bakterien (B. Bronchiseptika Feldisolat Bb24/12) in einem Mittelwert von vier Medien aus drei unabhängigen Experimenten.

S2-Datei.

Tabelle A. MIC-Werte von 10 B. Bronchiseptika Isolate, 20 antimikrobielle Wirkstoffe und zwei Inkubationszeiten in fünf Replikaten.


Transmission zu Extinktionstabelle

Absorption und Transmission sind Messungen, die in der Spektrophotometrie verwendet werden. Die Spektrophotometrie misst, wie viel Strahlungsenergie eine Substanz bei unterschiedlichen Lichtwellenlängen absorbiert. Die Technik ist nützlich, um die Identität einer unbekannten Substanz zu bestimmen und unter Verwendung eines Satzes von Standards die Konzentration einer Substanz in einer Probe zu bestimmen.

Eine Tabelle von Transmission zu Extinktion ermöglicht eine schnelle Umrechnung von Transmissionswerten in Extinktionen im Labor oder im Feld.


Abstrakt

Ziel dieser Studie war es, den Einfluss unterschiedlicher Wachstumstemperaturen auf den Widerstand von . zu untersuchen Escherichia coli O157:H7 und Salmonellen Typhimurium bis hin zu niederenergetischer Röntgenbestrahlung. Die Bestrahlung von kontaminierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,6 kGy-Röntgenstrahlen verringerte die Anzahl von E coli O157:H7 kultiviert bei 37 °C bis unter die Nachweisgrenze (<1,0 Koloniebildende Einheit (KBE)/ml) und die von E coli O157:H7 kultiviert bei 25 und 15 °C mit 4,82 bzw. 4,45 log KBE/ml. Die lebensfähigen Counts von S. Typhimurium, das bei 37, 25 und 15 °C in phosphatgepufferter Kochsalzlösung kultiviert wurde, nahm nach Bestrahlung mit 0,6 kGy-Röntgenstrahlen um 3,56, 3,08 bzw. 2,75 log KBE/ml ab. Die Bestrahlung von kontaminiertem Salat mit 0,4 kGy verringerte die Anzahl von E coli O157:H7 kultiviert bei 37, 25 und 15 °C mit 3,97, 3,45 bzw. 3,10 log KBE/cm 2 und denen von S. Typhimurium um 4,41, 3,84 bzw. 3,40 log CFU/cm 2 . Die Wachstumstemperatur beeinflusste die Resistenz des Pathogens gegenüber Röntgenbestrahlung durch Modulation der Zellmembran- und DNA-Integrität, der intrazellulären Enzymaktivität und der Effluxpumpenfunktion. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass der Stressresistenzstatus von pathogenen Bakterien, die bei verschiedenen Wachstumstemperaturen kultiviert wurden, für die Anwendung von Röntgenstrahlen zur Sterilisation von Frischprodukten berücksichtigt werden sollte.


Umrechnung der optischen Dichte in cfu / ml - Biologie

Die Messung der Extinktion sagt uns jedoch nicht, wie viele Zellen tatsächlich in der Kultur leben.

Eine einfache Möglichkeit, die Anzahl der lebenden Zellen zu zählen, besteht darin, ihre Fortpflanzungsfähigkeit auszunutzen. Auf einer mit Agar beschichteten Petrischale teilt sich jede lebensfähige Zelle wiederholt, aber ihre Nachkommen bleiben weitgehend immobilisiert – sie bilden eine Kolonie.

Die Zellen dieser Kolonie sind ein Klon der ursprünglichen Zelle, die auf der Agaroberfläche gelandet ist.

Durch das Zählen von Kolonien erhalten wir eine direkte Schätzung der Konzentration lebensfähiger Bakterien oder genauer gesagt der Anzahl der koloniebildende Einheiten - KBE pro ml in der ursprünglichen Kultur.

Um die Anzahl der KBE pro ml (KBE/ml) in einer Kultur zu bestimmen, wird eine kleine Probe oder aliquot bekanntem Volumen wird aus der Kultur entnommen und verdünnt in ein bekanntes Volumen steriler Medien.

Nach der Verdünnung mit einer bekannten Menge können wir die Anzahl der KBE in einem bekannten Volumen der verdünnten Lösung messen.

Dazu verteilen wir ein Aliquot der verdünnten Kultur, im Allgemeinen zwischen 10 und 200 &mgr;l, gleichmäßig über die Oberfläche einer LB-Agar-Petriplatte.

Bei Inkubation bei 37 °C wachsen die einzelnen Bakterien innerhalb von 18-24 Stunden zu gut sichtbaren Kolonien heran.

Verdünnungen zu machen ist eines der schwierigsten konzeptionellen Probleme, die Studenten haben!
Bitte überlegen Sie genau, was Sie tun! brauchen Sie eine Auffrischung? lesen Sie dies

Kennen Sie den Unterschied zwischen ml und µL?
Was bedeutet eine 10 -3 Verdünnung? Wie würden Sie einen einrichten.

Werden zu viele Bakterien auf einer Schale ausplattiert, wachsen die Kolonien zu einem zusammenhängenden Rasen .

Bakterienkonzentrationen können sehr hoch sein, deshalb ist es im Allgemeinen notwendig, a Verdünnungsreihe .

Nehmen Sie dazu ein Aliquot aus Ihrer ersten Verdünnung und verdünnen Sie es erneut, dann wiederholen Sie den Vorgang.

Dadurch können wir ein breites Spektrum an Konzentrationen abdecken.

Dieser Vorgang ist hier dargestellt

Es ist schwierig, mühsam und ungenau, mehr zu zählen als

300 Kolonien pro Platte, das können Sie sich selbst beweisen, wenn Sie wollen.

Gleichzeitig führt das Zählen von zu wenigen Kolonien zu zunehmenden Ungenauigkeiten aufgrund von Probenahmefehlern.

Sie müssen die KBE/ml in der Originalkultur bestimmen, um zu beweisen, dass Sie wissen, wie Verdünnungen durchgeführt werden.

Wenn Sie zu viele oder zu wenige Zellen ausplattieren, können Sie den Ausplattierungsprozess wiederholen, ohne eine neue Verdünnungsreihe erstellen zu müssen

Wissen Sie, wie man in der Originalkultur von KBE pro Platte auf KBE pro ml übergeht?

Was war der Titer Ihrer Kultur?
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Schau das Video: Umrechnung Dichteeinheiten (August 2022).