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6: Enzymaktivität und Proteinregulation - Biologie

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6: Enzymaktivität und Proteinregulation

Regulatorische Enzyme

Als Kinasen werden regulatorische Enzyme bezeichnet, die die Übertragung von Phosphatgruppen auf die spezifischen Substrate erleichtern. Proteinkinasen sind die zahlreichen Gruppen von Kinasen, die an der Regulierung der Zellfunktion und weiteren Modifikation beteiligt sind. In Prokaryoten und Eukaryoten üben mehrere Proteinkinasen eine spezifische und reversible Kontrolle der Proteinphosphorylierung aus. Proteinkinasen werden sowohl nach der Art der Aminosäure, die sie im Proteinziel phosphorylieren, als auch nach ihrer Position in der Zelle klassifiziert. Biochemisch unterscheidet die Phosphorylierung fünf verschiedene Gruppen, d. h. Histidin, Serin, Threonin oder Tyrosin, und Kinasen mit dualer Spezifität. Die Mehrzahl der eukaryontischen Kinasen sind Serin/Threonin-spezifische Proteinkinasen. Tyrosin-spezifische Proteinkinasen werden in Signaltransduktionsprozessen in Eukaryoten verwendet und eine geringe Aktivität ist in Hefe nachweisbar. Proteinkinasen sind im Zytosol und in der Plasmamembran etabliert. Ser/Thr-Proteinkinasen und die Dual-Spezifität-Kinasen sind am häufigsten zytosolisch. Die meisten Tyrosinkinasen befinden sich auf der Plasmamembran. Proteinkinasen haben tiefgreifende Wirkungen auf eine Zelle mit hochregulierter Aktivität durch Ein- und Ausschalten und durch Binden von Proteinen mit Vorteil als regulatorische Strategie. Die Regulation von Proteinkinasen ist in der eukaryotischen Entwicklung, Physiologie und im Stoffwechsel allgegenwärtig, und Deregulierung ist eine häufige Ursache von Krankheiten, insbesondere von Krebs.


Abstrakt

Multi-Ubiquitin-Ketten mit einer Länge von mindestens vier Untereinheiten sind für die effiziente Erkennung und den Abbau ubiquitylierter Proteine ​​durch das Proteasom erforderlich, aber es wurden andere Funktionen von Ubiquitin entdeckt, die das Proteasom nicht einbeziehen. Einige Proteine ​​werden durch ein einzelnes Ubiquitin oder kurze Ubiquitinketten modifiziert. Anstatt Proteine ​​durch das Proteasom in den Tod zu schicken, reguliert die Monoubiquitylierung Prozesse, die vom Membrantransport bis zur Transkriptionsregulation reichen.


Inhalt

Die CDK6 Gen ist in Eukaryoten konserviert, einschließlich der Knospungshefe und des Nematoden Caenorhabditis elegans. [11] Die CDK6 Gen befindet sich beim Menschen auf Chromosom 7. Das Gen umfasst 231.706 Basenpaare und kodiert ein 326 Aminosäuren langes Protein mit Kinasefunktion. [6] Das Gen wird bei Krebsarten wie Lymphomen, Leukämien, Medulloblastomen und Melanomen, die mit Chromosomenumlagerungen verbunden sind, überexprimiert. [6] Das CDK6-Protein enthält einen katalytischen Kern, der aus einer Serin/Threonin-Domäne besteht. [12] Dieses Protein enthält auch eine ATP-bindende Tasche, hemmende und aktivierende Phosphorylierungsstellen, eine PSTAIRE-ähnliche Cyclin-bindende Domäne und ein aktivierendes T-Schleifen-Motiv. [10] Nach Bindung des Cyclins in die PSTAIRE-Helix ändert das Protein seine Konformationsstruktur, um das Phosphorylierungsmotiv freizulegen. [10] Das Protein kann im Zytoplasma und im Zellkern gefunden werden, die meisten aktiven Komplexe befinden sich jedoch im Zellkern proliferierender Zellen. [10]

Zellzyklus Bearbeiten

1994 untersuchten Matthew Meyerson und Ed Harlow das Produkt eines eng analogen Gens von CDK4. [7] Dieses als PLSTIRE identifizierte Gen wurde in ein Protein übersetzt, das mit den Cyclinen CD1, CD2 und CD3 interagierte (wie CDK4), aber anders als CDK4 wurde das Protein dann der Einfachheit halber in CDK6 umbenannt. [7] In Säugerzellen wird der Zellzyklus durch CDK6 in der frühen G1-Phase [13] durch Interaktionen mit den Cyclinen D1, D2 und D3 aktiviert. [7] Es gibt viele Veränderungen in der Genexpression, die durch dieses Enzym reguliert werden. [14] Nach der Komplexbildung phosphoryliert der enzymatische C-CDK6-Komplex das Protein pRb. [15] Nach seiner Phosphorylierung setzt pRb seinen Bindungspartner E2F frei, einen Transkriptionsaktivator, der wiederum die DNA-Replikation aktiviert. [16] Der CDK6-Komplex sorgt für einen Umschaltpunkt, um sich zur Teilung zu verpflichten, die auf externe Signale wie Mitogene und Wachstumsfaktoren reagiert. [17]

CDK6 ist an einer positiven Rückkopplungsschleife beteiligt, die über eine Reaktionskaskade Transkriptionsfaktoren aktiviert. [18] Wichtig ist, dass diese C-CDK-Komplexe als Kinase fungieren, indem sie das Protein von Rb und p-Rb-verwandte „Taschenproteine“ p107 und p130 phosphorylieren und inaktivieren. [19] Dabei fungiert CDK6 in Verbindung mit CDK4 als Schaltsignal, das zuerst in G1 erscheint [7] und die Zelle in Richtung S-Phase des Zellzyklus lenkt. [14]

CDK6 ist wichtig für die Kontrolle des G1-zu-S-Phasenübergangs. [7] In den letzten Jahren haben jedoch neue Beweise gezeigt, dass das Vorhandensein von CDK6 nicht für die Proliferation in jedem Zelltyp essentiell ist, [20] der Zellzyklus hat einen komplexen Regulationskreislauf und die Rolle von CDK6 könnte in bestimmten Fällen wichtiger sein Zelltypen als in anderen, wo CDK4 oder CDK2 als Proteinkinasen wirken können, um ihre Rolle zu kompensieren. [20] [21]

Zelluläre Entwicklung Bearbeiten

Bei mutierten Knockout-Mäusen von CDK6 ist die hämatopoetische Funktion ungeachtet einer ansonsten normalen Entwicklung des Organismus beeinträchtigt. [20] Dies könnte auf eine zusätzliche Rolle von CDK6 bei der Entwicklung von Blutkomponenten hinweisen. [20] Es gibt zusätzliche Funktionen von CDK6, die nicht mit seiner Kinaseaktivität verbunden sind. [22] CDK6 ist beispielsweise an der Differenzierung von T-Zellen beteiligt und wirkt als Differenzierungsinhibitor. [22] Obwohl CDK6 und CDK4 71 % der Aminosäureidentität teilen, ist diese Rolle bei der Differenzierung einzigartig für CDK6. [22] CDK6 hat sich auch bei der Entwicklung anderer Zelllinien als wichtig erwiesen, zum Beispiel spielt CDK6 eine Rolle bei der Veränderung der Morphologie von Astrozyten [23] und bei der Entwicklung anderer Stammzellen. [10] [16]

DNA-Schutz Bearbeiten

CDK6 unterscheidet sich von CDK4 in anderen wichtigen Rollen. [24] CDK6 spielt beispielsweise eine Rolle bei der Akkumulation der Apoptoseproteine ​​p53 und p130, diese Akkumulation verhindert, dass Zellen bei DNA-Schäden in die Zellteilung eintreten und aktiviert proapoptotische Wege. [24]

Metabolische Homöostase Bearbeiten

Studien zur metabolischen Kontrolle von Zellen haben eine weitere Rolle von CDK6 gezeigt. [25] Diese neue Rolle ist mit dem Gleichgewicht der oxidativen und nicht-oxidativen Zweige des Pentosewegs in Zellen verbunden. [25] Dieser Weg ist ein bekannter Weg, der in Krebszellen verändert wird, wenn eine abweichende Überexpression von CDK6 und CDK4 vorliegt. [25] Die Überexpression dieser Proteine ​​verleiht den Krebszellen eine neue charakteristische Fähigkeit des Krebses, den Zellstoffwechsel zu deregulieren. [25]

Zentrosomstabilität Bearbeiten

Im Jahr 2013 entdeckten Forscher eine weitere Rolle von CDK6. [26] Es gibt Hinweise darauf, dass CDK6 mit dem Zentrosom assoziiert und die organisierte Teilung und die Zellzyklusphasen bei der Neuronenproduktion kontrolliert. [26] Wenn das CDK6-Gen in diesen sich entwickelnden Linien mutiert ist, werden die Zentrosomen nicht richtig geteilt, was zu Teilungsproblemen wie Aneuploidie führen kann, was wiederum zu Gesundheitsproblemen wie primärer Mikrozephalie führt. [26]

CDK6 wird hauptsächlich durch seine Vereinigung mit den D-Cyclinen D1, D2 und D3 positiv reguliert. Wenn diese Untereinheit des Komplexes nicht verfügbar ist, ist CDK6 nicht aktiv oder verfügbar, um das pRb-Substrat zu phosphorylieren. [9] Ein zusätzlicher positiver Aktivator, der von CDK6 benötigt wird, ist die Phosphorylierung in einem konservierten Threoninrest in Position 177, diese Phosphorylierung wird durch die cdk-aktivierenden Kinasen, CAK, durchgeführt. [27] Darüber hinaus kann CDK6 durch das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus phosphoryliert und aktiviert werden, wodurch das CDK6 über die Aktivierung und unkontrollierte Zellproliferation stimuliert wird. [28]

CDK6 wird negativ reguliert durch die Bindung an bestimmte Inhibitoren, die in zwei Gruppen eingeteilt werden können [29] CKIs oder CIP/KIP-Familienmitglieder wie das Protein p21 [16] und p27 wirken blockierend und hemmend die assemblierten C-CDKs-Bindungskomplexenzyme [27] in ihrer katalytischen Domäne. [30]

Darüber hinaus hemmen Inhibitoren der INK4-Familienmitglieder wie p15, p16, p18 und p19 das Monomer von CDK6 und verhindern so die Komplexbildung. [19] [31]

CDK6 ist eine Proteinkinase, die die Zellproliferation aktiviert, sie ist an einer wichtigen Restriktionsstelle im Zellzyklus beteiligt. [18] Aus diesem Grund ist bekannt, dass CDK6 und andere Regulatoren der G1-Phase des Zellzyklus in mehr als 80-90% der Tumoren unausgeglichen sind. [9] In Gebärmutterhalskrebszellen wurde gezeigt, dass die CDK6-Funktion indirekt durch den p16-Inhibitor verändert wird. [31] CDK6 wird auch in Tumoren überexprimiert, die Arzneimittelresistenz aufweisen, z. B. weisen maligne Gliome eine Resistenz gegenüber einer Chemotherapie mit Temozolomid (TMZ) auf, wenn sie eine Mutation aufweisen, die CDK6 überexprimiert. [32] Ebenso ist die Überexpression von CDK6 auch mit einer Resistenz gegenüber einer Hormontherapie mit dem Antiöstrogen Fluvestrant bei Brustkrebs verbunden. [33]

Krebs Bearbeiten

Der Verlust der normalen Zellzykluskontrolle ist der erste Schritt zur Entwicklung verschiedener Kennzeichen von Krebsveränderungen von CDK6 kann direkt oder indirekt die folgenden Kennzeichen beeinflussen: disregulierte Zellenergie, Aufrechterhaltung der proliferativen Signalübertragung, Umgehen von Wachstumssuppressoren und Induzieren von Angiogenese, [9] zum Beispiel: Es hat sich gezeigt, dass die Deregulierung von CDK6 bei lymphoiden Malignomen wichtig ist, indem sie die Angiogenese, ein Kennzeichen von Krebs, erhöht. [19] Diese Merkmale werden durch eine Hochregulierung von CDK6 aufgrund von Chromosomenveränderungen oder epigenetischen Fehlregulationen erreicht. [9] Darüber hinaus könnte CDK6 durch genomische Instabilität verändert werden, einen Mechanismus der Herunterregulierung von Tumorsuppressorgenen, der ein weiteres sich entwickelndes Kennzeichen von Krebs darstellt. [34]

Medulloblastom Bearbeiten

Das Medulloblastom ist die häufigste Ursache von Hirntumoren bei Kindern. [35] Etwa ein Drittel dieser Krebsarten hat CDK6 hochreguliert, was einen Marker für eine schlechte Prognose dieser Krankheit darstellt. [35] Da es bei diesen Zellen so häufig vorkommt, dass sie CDK6-Veränderungen aufweisen, suchen Forscher nach Wegen, die CDK6-Expression, die spezifisch in diesen Zelllinien wirkt, herunterzuregulieren. Die MicroRNA (miR) -124 hat die Krebsprogression erfolgreich kontrolliert in-vitro Einstellung für Medulloblastom- und Glioblastomzellen. [35] Darüber hinaus haben Forscher herausgefunden, dass es das Wachstum von Xenotransplantat-Tumoren in Rattenmodellen erfolgreich reduziert. [35]

Als Drogenziel Bearbeiten

Das direkte Targeting von CDK6 und CDK4 sollte in der Krebstherapie mit Vorsicht verwendet werden, da diese Enzyme auch für den Zellzyklus normaler Zellen wichtig sind. [35] Darüber hinaus könnten kleine Moleküle, die auf diese Proteine ​​abzielen, Arzneimittelresistenzen verstärken. [35] Es wurde jedoch gezeigt, dass diese Kinasen als Coadjuvanzien bei der Chemotherapie von Brustkrebs nützlich sind. [36] Ein weiterer indirekter Mechanismus zur Kontrolle der CDK6-Expression ist die Verwendung eines mutierten D-Cyclins, das mit hoher Affinität an CDK6 bindet, aber dessen Kinaseaktivität nicht induziert. [36] Dieser Mechanismus wurde bei der Entwicklung der Mammatumorogenese in Rattenzellen untersucht, jedoch wurden die klinischen Wirkungen bei menschlichen Patienten noch nicht gezeigt. [36] A


MP4. Regulierung von Stoffwechselwegen: Wie wird sie reguliert?

  • Von Chris Schaller
  • Professor (Chemie) am College of Saint Benedict/Saint John's University

Exquisite Mechanismen haben sich entwickelt, die den Fluss von Metaboliten durch Stoffwechselwege kontrollieren, um sicherzustellen, dass der Output der Wege den biologischen Bedarf deckt und dass keine Energie in Form von ATP verschwendet wird, indem entgegengesetzte Wege gleichzeitig in derselben Zelle ablaufen.

Enzyme können reguliert werden, indem die Aktivität eines bereits vorhandenen Enzyms oder die Menge eines Enzyms geändert wird.

A. Änderung der Aktivität eines bereits vorhandenen Enzyms: Der schnellste Weg, die Aktivität eines Enzyms zu modulieren, besteht darin, die Aktivität eines bereits in der Zelle vorhandenen Enzyms zu ändern. Die folgende Liste, die in der folgenden Abbildung dargestellt ist, zeigt allgemeine Möglichkeiten zur Regulierung der Enzymaktivität

  1. Substratverfügbarkeit: Substrate (Reaktanten) binden an Enzyme mit einer charakteristischen Affinität (gekennzeichnet durch eine Dissoziationskonstante) und einem kinetischen Parameter namens Km (Einheiten der Molarität). Wenn die tatsächliche Konzentration eines Substrats in einer Zelle viel geringer ist als die Km, ist die Aktivität des Enzyms sehr gering. Wenn die Substratkonzentration viel größer als Km ist, ist das aktive Zentrum des Enzyms mit Substrat gesättigt und das Enzym ist maximal aktiv.
  2. Produkthemmung: Ein Produkt einer enzymkatalysierten Reaktion ähnelt oft einem Ausgangsreaktanten, daher sollte klar sein, dass das Produkt auch an die Aktivitätsstelle binden sollte, wenn auch wahrscheinlich mit geringerer Affinität. Unter Bedingungen, bei denen das Produkt einer Reaktion in hoher Konzentration vorliegt, wäre es für die Zelle energetisch vorteilhaft, wenn kein Produkt mehr synthetisiert würde. Daher wird häufig eine Produkthemmung beobachtet. Ebenso ist es für eine Zelle energetisch vorteilhaft, wenn das Endprodukt eines gesamten Stoffwechselweges ebenfalls an das Ausgangsenzym in den Stoffwechselwegen binden und dieses hemmen könnte, wodurch der gesamte Stoffwechselweg gehemmt werden kann. Diese Art der Rückkopplungshemmung wird häufig beobachtet
  1. Allosterische Regulation: Da viele Wege miteinander verbunden sind, wäre es optimal, wenn die Moleküle eines Weges die Aktivität von Enzymen in einem anderen miteinander verbundenen Weg beeinflussen würden, selbst wenn die Moleküle des ersten Weges strukturell von Reaktanten oder Produkten eines zweiten Weges verschieden sind. Moleküle, die an andere Stellen auf Zielenzymen als das aktive Zentrum (allosterische Stellen) binden, können die Aktivität des Zielenzyms regulieren. Diese Moleküle können sich strukturell von denen unterscheiden, die am aktiven Zentrum binden. Sie tun dies durch Konformationsänderungen, die die Aktivität des Zielenzyms entweder aktivieren oder hemmen können.
  2. pH-Wert und Enzymkonformation: pH-Änderungen, die metabolische Prozesse wie die Atmung begleiten können (z. B. aerobe Glykolyse), können die Konformation eines Enzyms und damit die Enzymaktivität verändern. Die anfänglichen Veränderungen sind kovalent (Änderung des Protonierungszustands des Proteins), was zu einer Veränderung des empfindlichen Gleichgewichts der Kräfte führen kann, die die Proteinstruktur beeinflussen.
  3. pH-Wert und Protonierungszustand des aktiven Zentrums: Änderungen des pH-Werts können den Protonierungszustand der wichtigsten Aminosäureseitenketten im aktiven Zentrum von Proteinen beeinflussen, ohne die lokale oder globale Konformation des Proteins zu beeinträchtigen. Die Katalyse kann beeinträchtigt werden, wenn der Katalysemechanismus ein Nukleophil des aktiven Zentrums umfasst (z. B.), das für seine Aktivität deprotoniert werden muss.
  4. Kovalente Modifikation: Viele, wenn nicht die meisten Proteine ​​unterliegen posttranslationalen Modifikationen, die die Enzymaktivität durch lokale oder globale Formänderungen, durch Förderung oder Hemmung der Bindungswechselwirkung von Substraten und allosterischen Regulatoren und sogar durch Veränderung der Position des Proteins innerhalb des Proteins beeinflussen können Zelle. Proteine ​​können phosphoryliert, acetyliert, methyliert, sulfatiert, glykosyliert, amidiert, hydroxyliert, prenyliert, myristoliert sein, oft auf reversible Weise. Einige dieser Modifikationen sind reversibel. Die Regulation durch Phosphorylierung durch die Wirkung von Kinasen und Dephosphorylierung durch Phosphate ist sehr verbreitet. Die Kontrolle des Phosphorylierungszustands wird durch einen Signaltransduktionsprozess vermittelt, der an der Zellmembran beginnt und zur Aktivierung oder Hemmung von Proteinkinasen und Phosphatasen innerhalb der Zelle führt.

Abbildung: Regulation der Aktivität bereits vorhandener Enzyme

Extrazellulär regulierte Kinase 2 (ERK2), auch bekannt als Mitogen-Aktivierungsproteinkinase 2 (MAPK2) ist ein Protein, das eine wichtige Rolle bei der Zellsignalübertragung durch die Zellmembran spielt. Die Phosphorierung von ERK2 an Threonin 183 (Thr153) und Tyrosin 185 (Tyr185) führt zu einer strukturellen Veränderung des Proteins und zur Regulation seiner Aktivität.

B. Ändern der Enzymmenge: Eine andere und weniger unmittelbare, aber längerfristige Methode zur Modulation der Aktivität eines Enzyms besteht darin, die Aktivität eines bereits in der Zelle vorhandenen Enzyms zu ändern. Die folgende Liste, die in der folgenden Abbildung dargestellt ist, zeigt, wie die Enzymkonzentration reguliert wird.

  1. Wechsel in der Transkription des Enzymgens: Extrazelluläre Signale (Hormone, Neurotransmitter usw.) können zu Signaltransduktionsreaktionen und schließlich zur Aktivierung oder Hemmung der Transkription des Gens für ein Proteinenzym führen. Diese Veränderungen resultieren aus der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren (Proteinen) an DNA-Sequenzen, die die Transkription des Enzymgens regulieren.
  2. Abbau von Boten-RNA für das Enzym: Der Gehalt an Boten-RNA für ein Protein bestimmt direkt die Menge dieses synthetisierten Proteins. Kleine Inhibitor-RNAs, abgeleitet von microRNA-Molekülen, die von zellulärer DNA transkribiert wurden, können an spezifische Sequenzen in der mRNA eines Zielenzyms binden. Der resultierende doppelsträngige RNA-Komplex rekrutiert ein Enzym (Dicer), das den Komplex mit dem Effekt spaltet, dass die Translation des Proteinenzyms von seiner mRNA verringert wird.
  3. Co/Post translationale Veränderungen: Sobald ein Proteinenzym von seiner mRNA translatiert wurde, kann es Veränderungen erfahren, um die Enzymspiegel zu beeinflussen. Einige Proteine ​​werden in einer "Vor"-Form synthetisiert, die gezielt und begrenzt durch Proteasen gespalten werden muss, um das Proteinenzym zu aktivieren. Einige Proteine ​​sind nicht vollständig gefaltet und müssen an andere Faktoren in der Zelle binden, um eine katalytisch aktive Form anzunehmen. Schließlich kann vollständig aktives Protein durch das Proteasom, einen Komplex innerhalb von Zellen, oder in Lysosomen, die Organellen innerhalb von Zellen sind, die proteolytische Enzyme enthalten, vollständig proteolysiert werden.

Als nächstes werden wir betrachten, welche Enzyme in Signalwegen das beste Ziel für die Regulierung sind.


Antikörper-Arrays in der Biomarker-Entdeckung

Jarad J. Wilson, . Ruo-Pan Huang, Fortschritte in der klinischen Chemie, 2015

1.5.1 Proteinexpression

Erstens bieten Proteinexpressionsniveaus einen einzigartigen Einblick in die Existenz ganzer Proteine ​​in einem System, wenn sie zur Markierung eines biologischen Zustands verwendet werden. Veränderungen des normalen Proteinspiegels können darauf hinweisen, dass das System aus dem Ruder gelaufen ist. Die Spiegel eines Proteins können als Reaktion auf einen bestimmten biologischen Zustand oder eine bestimmte Krankheit steigen oder fallen. C-reaktives Protein (CRP) ist ein gutes Beispiel für einen wichtigen Biomarker, der während oder als Reaktion auf eine Entzündung hochreguliert wird. Es wird in der Leber als Reaktion auf Faktoren synthetisiert, die sowohl von Makrophagen als auch von Adipozyten während einer Entzündungsreaktion sezerniert werden. CRP ist als Biomarker besonders wertvoll, da es den Status einer Entzündungsreaktion misst, die durch unzählige Krankheiten oder medizinische Störungen ausgelöst werden könnte [8] .


Synthese von Mevalonat aus Acetyl-CoA

Die erste Stufe der Cholesterinsynthese führt zur Produktion des Zwischenprodukts Mevalonat. Die Synthese von Mevalonat ist der engagierte, geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Cholesterinbildung. Bei dieser Reaktion kondensieren zwei Moleküle Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA, das dann mit einem dritten Molekül Acetyl-CoA kondensiert, um die Sechs-Kohlenstoff-Verbindung (eta)-Hydroxy-(eta) zu ergeben. -Methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) (Abbildung 6.3), (die zytosolische HMG-CoA-Synthase in dieser Reaktion unterscheidet sich von der mitochondrialen HMG-CoA-Synthase, die eine ähnliche Reaktion katalysiert, die an der Produktion von Ketonkörpern beteiligt ist). Der entscheidende Schritt und Hauptpunkt der Regulierung der Cholesterinsynthese ist die Reduktion von HMG-CoA zu Mevalonat in einer Reaktion, die durch katalysiert wird HMG-CoA-Reduktase.

Abbildung 6.3: Regulatorischer Schritt, katalysiert durch HMG-CoA-Reduktase.

Die nachfolgenden Schritte des Reaktionswegs verlaufen weitgehend unreguliert und Mevalonat wird verwendet, um Isoprenoid-Einheiten (5-Kohlenstoff-Einheiten) zu synthetisieren. Diese 5-Kohlenstoff-Ketten sind kopf-an-schwanz verbunden, wodurch Squalen mit 30 Kohlenstoffatomen erzeugt wird, das nach der Epoxidierung eine Cyclisierungsreaktion eingeht. Das cyclisierte Produkt Lanosterol durchläuft mehrere Reaktionen, um das Endprodukt Cholesterin zu erzeugen.


HINTERGRUNDTHEORIE UND VORLABORVORBEREITUNG

Der Nährstoffstoffwechsel ist ein streng regulierter Prozess, bei dem verschiedene Arten von Geweben, Zellen, Organellen und Biomolekülen an der Koordination und Regulierung des Stoffwechsels beteiligt sind. Bei höheren Tieren kann die Aktivität des regulierenden Enzyms eines biochemischen Stoffwechselwegs durch kurz- und langfristige Mechanismen reguliert werden. Abhängig von den physiologischen Bedürfnissen kann die genetische Kontrolle der Enzymsynthese die verfügbare Enzymmenge über einen langfristigen Mechanismus regulieren [ 6 – 8 ].

Die Enzyme, die am Stoffwechsel von Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden beteiligt sind, können auch durch einen kurzfristigen Mechanismus reguliert werden. Einer dieser Mechanismen ist die allosterische Regulation, bei der die Bindung kleiner Moleküle, die ein Aktivator, Inhibitor oder Substrat (Modulatoren) sein können, die Enzymaktivität erhöht oder verringert. Somit kann die Enzymaktivität nach physiologischen Bedürfnissen reguliert werden, die während des Zelllebens auftreten können [ 6 , 7 ].

Enzymaktivitäten können auch durch reversible kovalente Modifikationen reguliert werden, wie die Addition von Phosphatgruppen an Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste. Die kovalente Modifikation ist ein hocheffizienter Weg, um nicht nur Enzyme bei Stoffwechselreaktionen wie der Glykogensynthese und -abbau zu kontrollieren, sondern auch viele andere zelluläre Funktionen, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung [ 6 – 8 ].

Ein weiterer wichtiger Mechanismus zur Regulierung der Proteinfunktion ist die proteolytische Aktivierung, die wie Schalter wirken kann, die Proteine ​​„an“ und „aus“ schalten. Die proteolytische Aktivierung ist eine spezielle Form der kovalenten Modifikation, bei der die inaktive Vorstufe des Enzyms durch eine irreversible Spaltung aktiviert wird. Enzyme, die bei Verdauungs- und Blutgerinnungsvorgängen aktiv sind, werden durch proteolytische Spaltung eingeschaltet. Im Allgemeinen werden diese Proenzyme als etwas längere Polypeptidketten als echte aktive Enzyme synthetisiert und sind normalerweise Teil einer Kaskade von Mechanismen. Wie in Fig. 1 beobachtet, wird Trypsinogen nach der Sekretion im Duodenum durch Enteropeptidase in Trypsin umgewandelt, die eine einzigartige Lysin-Isoleucin-Peptidbindung in Trypsinogen hydrolysiert. Die Hydrolyse macht Trypsin aktiv, das auch die Fähigkeit besitzt, Trypsinogen zu aktivieren, indem es Arg- und Lys-Reste spaltet und dann mehr Trypsin erzeugt [5]. Darüber hinaus löst Trypsin auch eine Kaskadenaktivierung anderer proteolytischer Enzyme aus, und das resultierende Enzymgemisch umfasst Endopeptidasen (Trypsin, Chymotrypsin und Elastase) und Exopeptidasen (Carboxypeptidasen A und B). Somit ist die Trypsinbildung durch Enteropeptidase der wesentliche Aktivierungsschritt [2].

Allgemeiner Hinweis-

In diesem Experiment beschreiben wir eine Methodik, die an die Verwendung von Trypsinogen, Chymotrypsinogen und Enteropeptidase von Masthühnern, Schweinen, Fischen und Wiederkäuern aufgrund der Leichtigkeit der Gewinnung dieser Tiere angepasst ist. Alternativ können auch andere Tiere wie Meerschweinchen, Mäuse oder Kaninchen verwendet werden.

Im Allgemeinen verwendet dieses Experiment einige gefährliche Reagenzien, wie Essigsäure, P-Nitroanilid, n,n-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid.

Diese Reagenzien sollten gemäß ihrer Handhabungsanweisungen gehandhabt und gemäß den örtlichen Sicherheitsvorschriften entsorgt werden.


6: Enzymaktivität und Proteinregulation - Biologie

Abstrakt

Vom Menschen bis zu einzelligen Bakterien hängt das Leben aller Organismen von den Stoffwechselreaktionen in ihrem Körper ab. Das ordnungsgemäße Funktionieren eines Organismus hängt daher grundlegend von der richtigen Regulierung dieser biochemischen Reaktionen ab. Und hier spielen Enzyme eine zentrale Rolle. Enzyme sind Proteine, die chemische Reaktionen katalysieren (d. h. die Geschwindigkeiten erhöhen oder verringern). Bei enzymatischen Reaktionen werden die Moleküle am Anfang des Prozesses Substrate genannt und sie werden in verschiedene Moleküle umgewandelt, die als Produkte bezeichnet werden. Fast alle Prozesse in einer biologischen Zelle benötigen Enzyme, um mit signifikanter Geschwindigkeit ablaufen zu können. Da Enzyme für ihre Substrate selektiv sind und nur wenige Reaktionen von vielen Möglichkeiten beschleunigen, bestimmt die Menge der in einer Zelle gebildeten Enzyme, welche Stoffwechselwege in dieser Zelle ablaufen.

Wie alle Katalysatoren wirken Enzyme, indem sie die Aktivierungsenergie (Ea&Dagger) für eine Reaktion senken und so die Reaktionsgeschwindigkeit dramatisch erhöhen. Dadurch werden Produkte schneller gebildet und Reaktionen erreichen schneller ihren Gleichgewichtszustand. Die meisten Enzymreaktionsgeschwindigkeiten sind millionenfach schneller als die vergleichbarer unkatalysierter Reaktionen. Wie bei allen Katalysatoren werden Enzyme nicht durch die Reaktionen verbraucht, die sie katalysieren.

Die Enzymaktivität kann durch andere Moleküle beeinflusst werden. Inhibitoren sind Moleküle, die die Enzymaktivität verringern Aktivatoren sind Moleküle, die die Aktivität erhöhen. Viele Medikamente und Gifte sind Enzymhemmer. Die Aktivität wird auch durch die Temperatur, die chemische Umgebung (z. B. pH) und die Substratkonzentration beeinflusst. Einige Enzyme werden kommerziell verwendet, beispielsweise bei der Synthese von Antibiotika.

Strukturen und Mechanismen

Banddiagramm, das die menschliche Carboanhydrase II zeigt. Die graue Kugel ist der Zink-Cofaktor im aktiven Zentrum. Diagramm aus PDB 1MOO gezeichnet. Enzyme sind im Allgemeinen kugelförmige Proteine ​​und haben eine Größe von nur 62 Aminosäureresten bis zu über 2.500 Resten. Es gibt eine kleine Anzahl von biologischen Katalysatoren auf RNA-Basis, wobei die gebräuchlichsten die Ribosomen sind, die entweder als RNA-Enzyme oder Ribozymen bezeichnet werden. Die Aktivitäten von Enzymen werden durch ihre dreidimensionale Struktur bestimmt. Obwohl die Struktur die Funktion bestimmt, ist die Vorhersage der Aktivität eines neuen Enzyms allein aus seiner Struktur ein sehr schwieriges Problem, das noch nicht gelöst wurde.

Die meisten Enzyme sind viel größer als die Substrate, auf die sie einwirken, und nur ein kleiner Teil des Enzyms (etwa 3–4 Aminosäuren) ist direkt an der Katalyse beteiligt. Der Bereich, der diese katalytischen Reste enthält, das Substrat bindet und dann die Reaktion ausführt, wird als aktives Zentrum bezeichnet. Enzyme können auch Stellen enthalten, die Cofaktoren binden, die für die Katalyse benötigt werden. Einige Enzyme haben auch Bindungsstellen für kleine Moleküle, die oft direkte oder indirekte Produkte oder Substrate der katalysierten Reaktion sind. Diese Bindung kann dazu dienen, die Aktivität des Enzyms zu erhöhen oder zu verringern, wodurch ein Mittel zur Rückkopplungsregulation bereitgestellt wird.

Wie alle Proteine ​​sind Enzyme lange, lineare Ketten von Aminosäuren, die sich zu einem dreidimensionalen Produkt falten. Jede einzigartige Aminosäuresequenz erzeugt eine spezifische Struktur mit einzigartigen Eigenschaften. Einzelne Proteinketten können sich manchmal zu einem Proteinkomplex zusammenschließen. Die meisten Enzyme können denaturiert werden, das heißt durch Erhitzen oder chemische Denaturierungsmittel, die die dreidimensionale Struktur des Proteins zerstören, entfaltet und inaktiviert werden. Je nach Enzym kann die Denaturierung reversibel oder irreversibel sein.

Besonderheit

Enzyme sind in der Regel sehr spezifisch, welche Reaktionen sie katalysieren und welche Substrate an diesen Reaktionen beteiligt sind. Für diese Spezifität sind komplementäre Form, Ladung und hydrophile/hydrophobe Eigenschaften von Enzymen und Substraten verantwortlich.

Einige der Enzyme mit der höchsten Spezifität und Genauigkeit sind an der Kopie und Expression des Genoms beteiligt. Diese Enzyme haben "Korrektur-Lese"-Mechanismen. Dabei katalysiert ein Enzym wie die DNA-Polymerase in einem ersten Schritt eine Reaktion und überprüft dann in einem zweiten Schritt die Korrektheit des Produkts. Dieser zweistufige Prozess führt zu durchschnittlichen Fehlerraten von weniger als 1 Fehler in 100 Millionen Reaktionen in High-Fidelity-Säuger-Polymerasen. Ähnliche Korrekturlesemechanismen finden sich auch bei RNA-Polymerase, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und Ribosomen.

"Schloss-und-Schlüssel"-Modell

Enzyme sind sehr spezifisch, und der Nobelpreisträger für organische Chemie, Emil Fischer, schlug 1894 vor, dass sowohl das Enzym als auch das Substrat spezifische komplementäre geometrische Formen besitzen, die genau ineinander passen. Dies wird oft als "Schloss-und-Schlüssel"-Modell bezeichnet. Obwohl dieses Modell die Enzymspezifität erklärt, erklärt es jedoch nicht die Stabilisierung des Übergangszustands, die Enzyme erreichen.

Diagramme zur Darstellung der induzierten Fit-Hypothese der Enzymwirkung.

1958 schlug Daniel Koshland eine Modifikation des Schlüssel-Schloss-Modells vor: Da Enzyme eher flexible Strukturen sind, wird das aktive Zentrum durch Wechselwirkungen mit dem Substrat ständig neu geformt, wenn das Substrat mit dem Enzym wechselwirkt. In einigen Fällen, wie beispielsweise bei Glykosidasen, ändert das Substratmolekül auch leicht seine Form, wenn es in das aktive Zentrum eintritt. Das aktive Zentrum ändert sich weiter, bis das Substrat vollständig gebunden ist, woraufhin die endgültige Form und Ladung bestimmt wird.

Mechanismen

Enzyme können auf verschiedene Weise wirken, die alle &DeltaG+ senken:

 Senken der Aktivierungsenergie durch Schaffung einer Umgebung, in der der Übergangszustand stabilisiert wird (z. B. Verspannung der Form eines Substrats&ndashdurch Bindung der Übergangszustands-Konformation der Substrat-/Produktmoleküle verzerrt das Enzym das/die gebundene(n) Substrat(e) in ihre Übergangszustandsform, wodurch die Energiemenge reduziert wird, die zum Vervollständigen des Übergangs erforderlich ist).

 Senken der Energie des Übergangszustands, aber ohne das Substrat zu verzerren, indem eine Umgebung mit der entgegengesetzten Ladungsverteilung zu der des Übergangszustands geschaffen wird.

 Bereitstellung eines alternativen Pfads. Zum Beispiel eine vorübergehende Reaktion mit dem Substrat, um einen intermediären ES-Komplex zu bilden, was ohne das Enzym unmöglich wäre.

 Reduzierung der Reaktionsentropieänderung durch Zusammenbringen von Substraten in der richtigen Orientierung zur Reaktion. Betrachtet man &DeltaH&Dagger allein, übersieht man diesen Effekt.

Dynamik und Funktion

Die interne Dynamik von Enzymen hängt mit ihrem Katalysemechanismus zusammen. Interne Dynamik ist die Bewegung von Teilen der Enzymstruktur, wie beispielsweise einzelner Aminosäurereste, einer Gruppe von Aminosäuren oder sogar einer ganzen Proteindomäne. Diese Bewegungen treten auf verschiedenen Zeitskalen auf, die von Femtosekunden bis Sekunden reichen. Netzwerke von Proteinresten in der gesamten Struktur eines Enzyms können durch dynamische Bewegungen zur Katalyse beitragen. Obwohl diese Bewegungen für die Bindung und Freisetzung von Substraten und Produkten wichtig sind, ist jedoch nicht klar, ob Proteinbewegungen dazu beitragen, die chemischen Schritte in enzymatischen Reaktionen zu beschleunigen. Diese neuen Erkenntnisse haben auch Auswirkungen auf das Verständnis allosterischer Wirkungen und die Entwicklung neuer Medikamente.

Allosterische Modulation

Allosterischer Übergang eines Enzyms zwischen R- und T-Zustand, stabilisiert durch einen Agonisten, einen Inhibitor und ein Substrat (das MWC-Modell)

Allosterische Stellen sind Stellen auf dem Enzym, die an Moleküle in der zellulären Umgebung binden. Die Stellen bilden mit diesen Molekülen schwache, nichtkovalente Bindungen, die eine Konformationsänderung des Enzyms bewirken. Diese Konformationsänderung überträgt sich auf das aktive Zentrum, das dann die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms beeinflusst. Allosterische Wechselwirkungen können Enzyme sowohl hemmen als auch aktivieren und sind ein üblicher Weg, um Enzyme im Körper zu kontrollieren.

Cofaktoren und Coenzyme

Cofaktoren

Einige Enzyme benötigen keine zusätzlichen Komponenten, um ihre volle Aktivität zu zeigen. Andere erfordern jedoch, dass Nicht-Protein-Moleküle, die Cofaktoren genannt werden, für die Aktivität gebunden werden. Cofaktoren können entweder anorganische (z. B. Metallionen und Eisen-Schwefel-Cluster) oder organische Verbindungen sein. Organische Cofaktoren können entweder prosthetische Gruppen sein, die fest an ein Enzym gebunden sind, oder Coenzyme, die während der Reaktion aus dem aktiven Zentrum des Enzyms freigesetzt werden. Coenzyme umfassen NADH, NADPH und Adenosintriphosphat. Diese Moleküle übertragen chemische Gruppen zwischen Enzymen.

Coenzyme

Raumfüllendes Modell des Coenzyms NADH

Coenzyme sind kleine organische Moleküle, die lose oder fest an ein Enzym gebunden sein können. Fest gebundene Coenzyme können als allosterische Gruppen bezeichnet werden. Coenzyme transportieren chemische Gruppen von einem Enzym zum anderen. Die getragenen chemischen Gruppen umfassen das von NAD oder NADP+ getragene Hydridion (H-), die von Adenosintriphosphat getragene Phosphatgruppe, die von Coenzym A getragene Acetylgruppe, von Folsäure getragene Formyl-, Methenyl- oder Methylgruppen und die von getragene Methylgruppe S-Adenosylmethionin.

Da Coenzyme als Folge der Enzymwirkung chemisch verändert werden, ist es sinnvoll, Coenzyme als eine spezielle Klasse von Substraten oder Zweitsubstraten zu betrachten, die vielen verschiedenen Enzymen gemeinsam sind. Es ist beispielsweise bekannt, dass etwa 700 Enzyme das Coenzym NADH verwenden.

Coenzymes are usually continuously regenerated and their concentrations maintained at a steady level inside the cell: for example, NADPH is regenerated through the pentose phosphate pathway. This continuous regeneration means that even small amounts of coenzymes are used very intensively. Zum Beispiel setzt der menschliche Körper täglich sein Eigengewicht an ATP um.

Inhibition

Competitive inhibitors bind reversibly to the enzyme, preventing the binding of substrate. On the other hand, binding of substrate prevents binding of the inhibitor. Substrate and inhibitor compete for the enzyme.

The coenzyme folic acid (left) and the anti-cancer drug methotrexate (right) are very similar in structure. As a result, methotrexate is a competitive inhibitor of many enzymes that use folates.

Competitive inhibition

In competitive inhibition, the inhibitor and substrate compete for the enzyme (i.e., they can not bind at the same time). Often competitive inhibitors strongly resemble the real substrate of the enzyme. For example, methotrexate is a competitive inhibitor of the enzyme dihydrofolate reductase, which catalyzes the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate. The similarity between the structures of folic acid and this drug are shown in the figure.

Unkompetitive Hemmung

In uncompetitive inhibition the inhibitor can not bind to the free enzyme, but only to the ES-complex. The EIS-complex thus formed is enzymatically inactive. This type of inhibition is rare, but may occur in multimeric enzymes.

Non-competitive inhibition

Non-competitive inhibitors can bind to the enzyme at the binding site at the same time as the substrate,but not to the active site. Both the EI and EIS complexes are enzymatically inactive. Because the inhibitor can not be driven from the enzyme by higher substrate concentration (in contrast to competitive inhibition), the apparent Vmax changes. But because the substrate can still bind to the enzyme, the Km stays the same.

Mixed inhibition

This type of inhibition resembles the non-competitive, except that the EIS-complex has residual enzymatic activity. This type of inhibitor does not follow Michaelis-Menten equation.

In many organisms inhibitors may act as part of a feedback mechanism. If an enzyme produces too much of one substance in the organism, that substance may act as an inhibitor for the enzyme at the beginning of the pathway that produces it, causing production of the substance to slow down or stop when there is sufficient amount. Dies ist eine Form von negativem Feedback. Enzymes which are subject to this form of regulation are often multimeric and have allosteric binding sites for regulatory substances. Their substrate/velocity plots are not hyperbolar, but sigmoidal (S-shaped).

Irreversible inhibitors react with the enzyme and form a covalent adduct with the protein. The inactivation is irreversible. These compounds include eflornithine a drug used to treat the parasitic disease sleeping sickness. Penicillin and Aspirin also act in this manner. With these drugs, the compound is bound in the active site and the enzyme then converts the inhibitor into an activated form that reacts irreversibly with one or more amino acid residues.

Biological Function

Enzymes serve a wide variety of functions inside living organisms. They are indispensable for signal transduction and cell regulation, often via kinases and phosphatases. They also generate movement, with myosin hydrolysing ATP to generate muscle contraction and also moving cargo around the cell as part of the cytoskeleton. Other ATPases in the cell membrane are ion pumps involved in active transport. Enzymes are also involved in more exotic functions, such as luciferase generating light in fireflies. Viruses can also contain enzymes for infecting cells, such as the HIV integrase and reverse transcriptase, or for viral release from cells, like the influenza virus neuraminidase.

An important function of enzymes is in the digestive systems of animals. Enzymes such as amylases and proteases break down large molecules (starch or proteins, respectively) into smaller ones, so they can be absorbed by the intestines. Starch molecules, for example, are too large to be absorbed from the intestine, but enzymes hydrolyse the starch chains into smaller molecules such as maltose and eventually glucose, which can then be absorbed. Different enzymes digest different food substances. In ruminants which have herbivorous diets, microorganisms in the gut produce another enzyme, cellulase to break down the cellulose cell walls of plant fiber.

Several enzymes can work together in a specific order, creating metabolic pathways. In a metabolic pathway, one enzyme takes the product of another enzyme as a substrate. After the catalytic reaction, the product is then passed on to another enzyme. Sometimes more than one enzyme can catalyze the same reaction in parallel, this can allow more complex regulation: with for example a low constant activity being provided by one enzyme but an inducible high activity from a second enzyme.

Glycolytic enzymes and their functions in the metabolic pathway of glycolysis

Enzymes determine what steps occur in these pathways. Without enzymes, metabolism would neither progress through the same steps, nor be fast enough to serve the needs of the cell. Indeed, a metabolic pathway such as glycolysis could not exist independently of enzymes. Glucose, for example, can react directly with ATP to become phosphorylated at one or more of its carbons. In the absence of enzymes, this occurs so slowly as to be insignificant. However, if hexokinase is added, these slow reactions continue to take place except that phosphorylation at carbon 6 occurs so rapidly that if the mixture is tested a short time later, glucose-6-phosphate is found to be the only significant product. Consequently, the network of metabolic pathways within each cell depends on the set of functional enzymes that are present.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Enzymes are used in the chemical industry and other industrial applications when extremely specific catalysts are required. However, enzymes in general are limited in the number of reactions they have evolved to catalyze and also by their lack of stability in organic solvents and at high temperatures. Consequently, protein engineering is an active area of research and involves attempts to create new enzymes with novel properties, either through rational design or in vitro evolution. These efforts have begun to be successful, and a few enzymes have now been designed "from scratch" to catalyze reactions that do not occur in nature.

Referenz

1. Comprehensive Laboratory Manual In Biology-XII 2. Biology Text For Class XII &ndash NCERT


Inhibitors: Molecules that bind to enzymes that prevent them from catalyzing reactions

  • If binding involves covalent bonds, then inhibition is often irreversible
  • If binding is weak, inhibition may be reversible

Competitive exclusion: The inhibitor binds to the same site as the substrate would, and blocks the substrate from binding to the enzyme

Non-competitive exclusion: The inhibitor binds somewhere other than the active site, changing the shape of the enzyme and blocking the substrate from binding